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CAR-T生產工藝流程及優化考量（上）

發布時間：2020-08-11 13:13 信息來源： 閱讀次數： 次

細胞毒性CD8+CART細胞，直接介導腫瘤細胞清除，但是CD4+輔助細胞(Th細胞)同樣有著重要作用。CD4+和CD8+CART應該有一個合適的比例，有報道，治療B-ALL中，1：1會獲得產生更好的腫瘤消退療效。



調節性T細胞浸潤到實體腫瘤局部，會降低CD28-CD3ζ信號通路活性。去除CD28CAR胞內段的Lck結合結構域，即使在調節性T細胞存在的情況下，也有強抗腫瘤活性。

低分化的初始樣T細胞（na?ve-like T cells ，TN cells，表型CD45RA+ CD45RO- CD95-，CCR7+，CD62L+，CD28+，CD27+)和干細胞記憶樣T細胞（Stem cell memory-like T cells ，TSCM cells，表型CD45RA+ CD45RO- CCR7+CD95+)具有更強的增殖能力和自我更新能力，以及分化為效應和記憶T細胞的能力，因而有產生更好臨床結果的潛能，更持久的抗腫瘤活性。

而分化的效應樣T細胞（T effector-like cells，TEff cells，表型CD45RA+ CCR7-)雖然體外表現初強的抗腫瘤活性，但是在體內，活化和增殖等能力均受損。

腫瘤高表達免疫檢查點配體，免疫細胞高表達免疫檢查點受體，則病人對于CART缺乏應答。

T細胞需要表達淋巴組織歸巢分子（CCR7和CD62L），有助于浸潤到腫瘤局部，起到更好的治療效果。如上文，TN和TSCM表達歸巢受體，而Teff不表達歸巢受體。高表達CXCR2和GD2也有助于CAR-T浸潤到腫瘤組織。


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1.  細胞分離和富集



分離方法：傳統方法Ficoll密度梯度離心用于去除顆粒細胞、紅細胞和血小板；自動化的分離系統：Sefia Cell Processing System，CliniMACS Prodigy。
基于CD3+進行細胞分選，然后以磁珠為基礎的技術如CliniMACS Prodigy，使用anti-CD3，anti-CD4，anti-CD8磁珠分選或者去除特定的細胞群，以獲得合理比例的CD4：CD8。

特定未分化的TN，TSCM，TCM細胞對于臨床是有益的，但是分選流程復雜，在實際生產流程中有一定困難。


2.  T細胞激活



2.1anti-CD3/anti-CD28抗體活化
使用抗CD3（OKT-3單克隆抗體）/抗CD28抗體包被磁珠作為人工抗原提呈顆粒，anti-CD3提供增殖信號，anti-CD28提供共刺激信號。活化之后，磁珠可被磁鐵去除掉。

和可溶性OKT-3抗體相比，抗體包被磁珠活化細胞，具有更少的分化，更少衰老的特點。另外富集和清洗細胞會更加簡單，昂貴抗體的丟失更少。因而磁珠法是生產工藝中最常用的方法，如諾華的Kymriah。

最近一種特殊的聚合物納米基體產品(T Cell TransAct)，上面結合有人源化CD3和CD28抗體，結合使用無血清培養基(TexMACS)，用于T細胞活化。這種方法增加了高表達CD62L，CCR7的 TCM細胞，減少CD57+耗竭T細胞，但是不改變PD-1的表達和基因轉染效率，而且細胞裂解活性降低。

2.2 Retronectin
Retronectin是另外一種活化策略，使用重組纖維連接片段，同時可以增加逆轉錄病毒的感染效率。Retronectin和板結合CD3抗體，或者anti-CD3/anti-CD28磁珠，用于GD2特異性CART和CD19特異性CART，增加TN和TSCM的比例。但是T細胞活化弱，擴增弱，細胞因子分泌少等是缺點。

2.3 人工APC細胞

人工APC遞呈TAA給CART，使其活化。比如使用K-562同時表達TAA和共刺激分子，不表達HLA-A，HLA-B，僅可用于TAA特異性CART活化。

3.  基因轉導系統

3.1病毒轉導

病毒轉染系統轉染效率高，最常用的是逆轉錄病毒載體和慢病毒載體。逆轉錄病毒將病毒DNA整合到宿主DNA中，產生穩定的轉染。慢病毒需要調節基因來中和宿主細胞的防御，削弱免疫反應，以及調節病毒復制。慢病毒載體，插入誘變和致癌的風險很低。

逆轉錄病毒生產需要大量的包裝細胞，而慢病毒載體生產需要大量質粒DAN進行瞬時轉染。病毒的生產需要GMP級別的生產車間和一系列的檢測方法，是病毒轉染細胞最大瓶頸。

諾華的Kymriah® (Tisagenlecleucel)和 施貴寶Lisocabtagene maraleucel (liso-cel; JCAR017)均使用慢病毒載體。Kite Yescarta (axicabtagene ciloleucel) 使用逆轉錄病毒。

3.2 基于質粒的基因傳遞

轉座子/轉座酶系統是一種替代的非病毒基因傳遞策略。采用“睡美人”轉座子/轉座酶系統進行CART制造。該系統由兩個DNA質粒組成，一個編碼CAR，第二表達轉座酶，這是切除和插入轉基因所必需的。這種方法不需要GMP車間生產病毒，成本低。在第一代CART和第三代CART中被使用，產品已經開始在臨床實驗中使用。

3.3 基因編輯

CRISPR/Cas9能夠特異性地破壞多個基因的基因組基因座。CRISPR/Cas9系統結合腺相關病毒(AAV)載體，將CAR的DNA整合入T細胞受體a，提高T細胞效力，抑制T細胞分化和衰竭。使用基因編輯和慢病毒轉導，用于產生PD-1缺陷的CD19特異性CART，增強抗腫瘤活性。



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